Nel 1941, quando la Seconda guerra mondiale contagiò l'URSS, Mosca fece costruire tre linee della metropolitana, per un totale di 21 stazioni. Durante la guerra, la metropolitana di giorno trasportava i passeggeri, e di notte si trasformava in un rifugio antiatomico. Durante i bombardamenti del 1941, la sotterranea ha protetto la bellezza di 13,9 milioni di persone. Nel 1942, quando i raid aerei divennero meno frequenti, quel numero scese a 303.000 persone. L'ultima granata cadde su Mosca nel giugno 1943, ma la metropolitana mantenne il suo status di rifugio antiaereo fino alla fine del conflitto.
Il primo segnale di allarme aereo suonò a Mosca un mese dopo l'inizio della guerra, il 22 luglio 1941. Circa 500.000 persone si rifugiarono nelle stazioni e nei tunnel costruiti all'epoca. La notte seguente ci fu un altro raid aereo: uno dei bombardamenti danneggiò il tunnel tra le stazioni di Smolenskaya e Arbatskaya, un altro colpì il cavalcavia di un ponte della metropolitana, e un terzo esplose all'ingresso di Arbatskaya. Decine di persone vennero uccise. A seguito di questo episodio vennero stilate delle regole per l'utilizzo della metropolitana come rifugio antiatomico.
Negli anni della guerra, la metro restava aperta fino alle ore 22, poi fino alle 5 del mattino veniva usata come rifugio. In caso di incursione aerea, i treni si fermavano immediatamente e il personale della metropolitana si preparava ad accogliere le persone. Mosca subì i bombardamenti peggiori nell'ottobre e nel novembre del 1941. A quel tempo, i treni sospendevano le corse dalle ore 17 alle 19. I moscoviti trascorrevano la notte nelle carrozze, nelle stazioni e nelle gallerie.
Secondo gli archivi della metropolitana di Mosca, nelle stazioni vennero installati 3.800 lettini e 4.600 posti letto per adulti. Sulle piattaforme apparvero fontanelle e rubinetti per l'acqua potabile e 25 bagni. Nelle stazioni c'erano medici in servizio in ogni momento. La sera, ai bambini venivano distribuiti latte e pane bianco. In alcune stazioni venivano addirittura organizzate proiezioni di film.
Nel novembre 1941 la stazione Kurskaya accolse una sezione della Biblioteca di Storia. "La visito quasi quotidianamente - confessò all’epoca un abitante di Mosca. - Non perché il mio viaggio di ritorno a casa passi attraverso questa stazione, ma perché vengo a leggere giornali e altre riviste".
La stazione di Chistye Prudy (che all'epoca si chiamava Kirovskaya) fu chiusa ai passeggeri e trasformata in uffici dello Stato Maggiore. All'inizio della guerra, il comando operativo, diretto da Joseph Stalin, si trovava in un edificio vicino all'ingresso della stazione, da dove si poteva prendere l'ascensore per il complesso sotterraneo del posto di comando e attraversare un passaggio pedonale nascosto nella stazione.
La piattaforma era protetta dal passaggio dei treni da una parete divisoria in compensato, e davanti alle scale mobili era stato issato un muro in cemento armato capace di fermare l'onda d'urto in caso di esplosione di una bomba aerea. Gli altri posti di comando militare erano situati nelle stazioni Krasnye Vorota, Belorusskaya e Ploshchad Sverdlova (ora Teatralnaya).
Nonostante i bombardamenti, la metropolitana di Mosca ha continuato a trasportare milioni di persone ogni giorno. L'unico giorno della sua storia in cui non è riuscita ad aprire in tempo è stato il 16 ottobre 1941: il giorno precedente, la dirigenza sovietica aveva deciso di distruggere la metropolitana per non cederla al nemico e di evacuare i treni e le altre attrezzature sul retro. Nella notte tra il 15 e il 16 ottobre erano in corso i preparativi per inondare le stazioni, si tagliavano i cavi elettrici e si smontavano le scale mobili, ma la mattina la decisione fu annullata e alle 18.45 la metropolitana riprese a funzionare. Tuttavia, parte dell'equipaggiamento era stato trasportato in Uzbekistan, e Mosca rimase solamente con 105 vagoni della metro. Se prima della guerra la metropolitana trasportava 27 milioni di passeggeri al mese, nell'ottobre 1941 la cifra non superava gli 8 milioni (oggi la metropolitana di Mosca trasporta questo numero di passeggeri in meno di un giorno!)
Durante la guerra, quando la maggior parte degli uomini era al fronte, la metropolitana era gestita per lo più da donne. Il primo "treno tutto al femminile", gestito solo da autisti donne, apparve l'8 marzo 1942. Le donne continuarono a lavorare nella sotterranea anche dopo la guerra. Alcuni depositi (ad esempio, quello della stazione di Sokol) erano utilizzati per produrre granate e mine.
Nonostante la guerra si continuò a costruire nuove stazioni e nuovi binari. Nel 1943, sotto il fiume Moscova, fu posato un tunnel per collegare Teatralnaya ad Avtozavodskaya, e nel 1944, un altro per unire Kurskaya a Izmailovsky Park. Sette stazioni della metropolitana di Mosca hanno targhe commemorative che dicono: "Costruita nei giorni della Seconda guerra mondiale".